Smart-seq3Xpress: eine skalierbare, hochsensible und kostengünstige Methode für die Einzelzell-Gesamt-RNA-Sequenzierung.

05.03.2024

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Dr. Weilin Liu, Senior Field Application Scientist

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Smart-seq3Xpress: eine skalierbare, hochsensible und kostengünstige Methode für die Einzelzell-Gesamt-RNA-Sequenzierung.
Smart-seq3Xpress: eine skalierbare, hochsensible und kostengünstige Methode für die Einzelzell-Gesamt-RNA-Sequenzierung.
Smart-seq3Xpress: eine skalierbare, hochsensible und kostengünstige Methode für die Einzelzell-Gesamt-RNA-Sequenzierung.

Einzellieferungssequenzierung, die eine hohe Auflösung von zellulären Unterschieden durch die Sequenzierung von Nukleinsäureinformationen, nämlich DNA und RNA aus einzelnen Zellen, ermöglicht, ist zu einer der Schlüsselanwendungen in der Next-Generation-Sequenzierung (NGS) geworden, um die individuelle Heterogenität in physiologischen Prozessen und die persönlichen Unterschiede in der Reaktion auf medizinische Behandlungen besser zu verstehen. Dies wirft ein Licht auf die Entdeckung neuer biologischer Mechanismen und personalisierter Therapien.

Derzeit kartieren die meisten Einzelzell-RNA-Sequenzierungs(scRNA-seq)-Methoden einen kurzen Teil der RNA-Moleküle, entweder vom 5'- oder 3'-Ende, zusammen mit einer eindeutigen molekularen Kennung (UMI)(Mereu et al., Nat. Biotechnol, 2020). Diese RNA-Endzählstrategien waren effizient bei der Schätzung der Genexpression in einer großen Anzahl von Zellen, während sie die PCR-Verstärkungsverzerrungen, die auf die geringe RNA-Eingabemenge zurückzuführen sind, kontrollierten und die Durchsatzkapazität der Sequenzierung kompensierten, aber die begrenzte Abdeckung dieser Methoden erschwerte die Erkennung der transkribierten genetischen Variationen und der Transkript-Isomerausdruck, die beispielsweise durch alternative RNA-Spleißen verursacht werden, was ein häufiger Mechanismus der RNA-Verarbeitung ist, und Abweichungen in einem solchen Prozess wurden mit der Entwicklung verschiedener Krankheiten in Verbindung gebracht, wie zum Beispiel Krebs und neurodegenerative Krankheiten (Zhang et al., Nature, 2021; Garcia-Blanco et al., Nat. Biotechnol, 2004; Mills et al., Neurobiol Aging, 2012).   Darüber hinaus ermöglichen zwar diese Endzähl-scRNA-seq eine höhere Sequenzierungskapazität in Bezug auf die Zellzahl, aber deren relativ geringe Empfindlichkeit und hohe Kosten sind die Hauptnachteile, die herausgefordert werden müssen. In der Zwischenzeit ermöglichen Langlesesequenzierungstechnologien die direkte Quantifizierung der Allel- und Isoformniveaunexpression, aber ihre derzeitige Lese-Tiefe, die fehlerhafte Fehlerquote und die Probenahmeverfahren behindern ihre breite Anwendung in Zellen, Geweben und Organismen (Byrne et al., Nat. Commum, 2017; Gupta et al., Nat. Biotechnol, 2018)

Um diese technischen Nachteile zu überwinden, haben Hagemann-Jensen und Ziegenhain et al. am Karolinska-Institut (Nat. Biotechnol, 2022; Nat. Biotechnol, 2020. https://www.nature.com/articles/s41587-022-01311-4) eine skalierbare und sensitive Kurzlesequenzierungsmethode, Smart-seq3xpress, entwickelt und weiter optimiert, um eine vollständige Abdeckung von RNA in voller Länge zu ermöglichen und vor allem eine beispiellose hohe Auflösung von einzelnen RNAs für Isoformen und ihre allelische Herkunft in einzelnen Zellen mit geringeren Betriebskosten und verkürzter Bibliothekvorbereitungsdauer auf einen Arbeitstag zu bieten. Das gut etablierte Smart-seq3xpress-Protokoll implementiert UMI am 5'-Ende von RNA-Transkripten in voller Länge, um eine eindeutige Identität jedes RNA-Moleküls zu etablieren. Die Einbeziehung von UMI verstärkt die Erkennung von Transkriptkopienzahlvariationen (CNV) und überwindet die durch PCR-Verstärkungsprozesse verursachten Verzerrungen, was die Sequenzierungsempfindlichkeit und -spezifität weiter erhöht. Darüber hinaus ist Smart-seq3xpress eine plattenbasierte Methode, die möglicherweise durch Automatisierungsprozesse von 96- in 384-Wellenplatten leicht skaliert werden kann. Praktischerweise können die Zellen von Interesse in den Wellenplatten in räumlicher und zeitlicher Weise getrennt werden, da die gefüllten Wellplatten jederzeit eingefroren werden können, bis sie weiterverarbeitet werden, was einen deutlichen Vorteil gegenüber der Methode darstellt, bei der die lebensfähige Zellsuspension sofort verarbeitet werden muss. Darüber hinaus hat diese Studie erhebliche Anstrengungen unternommen, um die wichtigsten Faktoren in der scRNA-seq zu miniaturisieren, einschließlich der Verringerung des Reaktionsvolumens, der Verringerung des Inputs von cDNA, der Verringerung der PCR-Zyklen und der Anpassung des Tn5- und cDNA-Verhältnisses für eine kostengünstigere Tagmentierung, ohne die Nachweisleistung zu beeinträchtigen. Darüber hinaus erfolgt eine Anpassung der Salzbestandteile und -konzentrationen, die Implementierung neuer Enzyme und die einzigartige Einstellung einer umfangreichen RNA-Zähl-QC unter Verwendung des selbstentwickelten neuen UMIcountR R-Pakets, um die Gesamterkennungsleistung von Smart-seq3xpress weiter zu verbessern. Darüber hinaus bietet diese Methode eine umweltfreundlichere und kostengünstigere Lösung, da die Material- und Ressourcenmenge im Vergleich zu anderen RNA-Sequenzierungsmethoden um das Zehnfache verringert ist und der Verbrauch von Kunststoff-Verbrauchsmaterialien durch neue 3D-gedruckte Werkzeuge und berührungsloses Portionieren von Reagenzien sowie vorab portionierte deszimierte Indexprimer wesentlich reduziert wird.

Abb. 1 | Skalierbare Volltranskriptabdeckung von scRNA-seq mit Smart-seq3xpress. a, Schema der Nanoliter-cDNA-Synthesereaktionen, die in Wells von 384-Well-PCR-Platten mit 3 µl hydrophobem Überzug durchgeführt werden. b, Darstellung von Experimenten mit reduziertem Volumen und den für die Lyse, RT und PCR verwendeten Volumina. c, Anzahl der detektierten Gene pro HEK293TF-Zelle bei jedem Reaktionsvolumen bei einer Probenahme von 100.000 Sequenzierungsreads (n=100, 19, 32 und 28 Zellen, jeweils). Der P-Wert stellt einen zweiseitigen t-Test zwischen den Bedingungen 10 µl und 1 µl dar. d, Einfluss von hydrophoben Überzügen auf miniaturisierte cDNA-Synthese (1 µl Gesamtvolumen). Für jede Verbindung zeigen die Kästen die Anzahl der detektierten Gene pro HEK293FT-Zelle (n=17, 34, 39, 28, 25, 24, 28, 38 und 70, jeweils), die bei 200.000 Sequenzierungsreads pro Zelle unterabgetastet wurden. e, Ersetzung der kugelbasierten cDNA-Reinigung durch Verdünnung in einzelnen HEK293FT-Zellen (n=58 und 52, jeweils). Die Boxplots zeigen die Anzahl der detektierten Gene pro Zelle und Bedingung (bei 100.000 Reads) mit P-Wert für einen zweiseitigen t-Test zwischen den Bedingungen. f, Tagmentierungskomplexität unter Verwendung von 0,1 µl ATM Tn5-Enzym pro HEK293FT-Zelle in Bezug auf die EingangscDNA. Die mittlere Anzahl der detektierten Gene als Funktion von rohen Sequenzierungsreads (n=51, 53, 54, 53, 53 und 52 Zellen für 25, 50, 75, 100, 200 und 500 pg, jeweils). g, Tagmentierungskomplexität für unterschiedliche Mengen an cDNA-Eingang. Die Komplexität wurde als eindeutig alignierte und genzuordnete UMI-enthaltende Read-Paare pro 400.000 Rohreads und HEK293FT-Zelle zusammengefasst (n=49, 51, 51, 50, 51 und 44). h, Schematische Darstellung der Smart-seq3- und Smartseq3xpress-Arbeitsabläufe. i, Anzahl der detektierten Gene mit Smart-seq3xpress nach variablen Mengen an PCR-Zyklen zur Vorausverstärkung. Die mittlere Anzahl der Gene wird als Funktion von rohen Sequenzierungsreads in HEK293FT-Zellen angegeben (n=93, 98, 108, 113, 102, 114 und 118 Zellen für 10, 12, 13, 14, 15, 16 oder 20 Zyklen, jeweils). j, Anteil der UMI-enthaltenden Reads an internen Reads für mit Smartseq3xpress (KAPA HiFi; 12 PCR-Zyklen) vorbereitete HEK293FT-Zellen bei einer variablen Reihe von TDE1 Tn5-Mengen (n=64 Zellen je). k, Anteil der UMI-enthaltenden Reads an internen Reads für mit Smartseq3xpress (SeqAmp; 12 PCR-Zyklen) vorbereitete HEK293FT-Zellen bei einer variablen Reihe von TDE1 Tn5-Mengen (n=60 Zellen je). l,m, Optimierung von RT- und PCR-Bedingungen über 376 Experimentalkonditionen an HEK293FT-Zellen. Die Farben kennzeichnen bestimmte Experimentalkonditionen: Smart-seq3xpress mit Smart-seq3 TSO (lila; n=912), 52 °C RT/alternativer TSO-Variante (gelb; n=74), feste Spacer-TSO-Variante (blau; n=45), FLASH-seq TSO-Variante (grün; n=55), Smart-seq3xpress mit verbesserter TSO (pink; n=63) und alle anderen Bedingungen (grau; n=21.707). Streudiagramme zeigen das Niveau von artefaktuellen TSO-UMI-Reads und RNA-Zählfehlern (l) sowie einen Prozentsatz der an ribosomaler RNA (rRNA) kartierten Reads und die Anzahl der detektierten Gene in 100.000 Reads nach Entfernung von Stranginvasionsreads (m). n, Benchmarking von Smart-seq3-Varianten. Die Boxplots zeigen die Anzahl der detektierten Gene pro HEK293FT-Zelle in der Vollvolumen-Smart-seq3 (ref. 2), der Niedervolumen-Smart-seq3 und der Smart-seq3xpress-Implementierungen bei den angegebenen Lesetiefen (n=109–110, 18–27, 9–170, 20–55 und 9–63 Zellen, abhängig von den bei den jeweiligen Sequenztiefen verfügbaren Zellen). Die Boxplots (in c, d, e, j, k und n) zeigen den Median sowie das erste und dritte Quartil als Box und die Whisker zeigen die äußersten Datenpunkte innerhalb von 1,5 Längen der Box. cSt, Centistroke.

Um Smart-seq3xpress zu demonstrieren, untersuchten Hagemann-Jensen und Ziegenhain et al. 26.260 humane periphere Blutmononukleärzellen (hPBMCs) mit einer durchschnittlichen Tiefe von 258.000 Reads pro Zelle. Die Ergebnisse zeigten ein vollständiges Transkriptprofil und die Rekonstruktion von T-Zell-Rezeptorsequenzen, wobei mehrere Zelltypen und -zustände identifiziert wurden, einschließlich unkonventioneller T-Zell-Populationen wie MAIT und gamma-delta T-Zellen, mit einer höheren Genentdeckung über Zelltypen hinweg. Bemerkenswert ist, dass diese Ergebnisse durch die Verwendung von fast 10-mal weniger hPBMCs im Vergleich zur Tropfen-basierten sc-RNAseq-Methode erzielt werden. In der folgenden Vergleichsstudie mit einer Tropfen-basierten Methode zeigte Smart-seq3xpress in mehreren Aspekten überlegene Leistungen in Bezug auf die Detektion von einzelnen Nukleotidpolymorphismen (SNPs) (9-fach höher), mehr Leseunterstützung über Exon-Exon/Exon-Intron-Spleißstellen durch seine Volltranskript-RNA-Abdeckung und T-Zell-Clustering-Konsistenz. Die Untersuchung von hPBMC Smart-seq3xpress-Daten zur alternativen Spleißung zeigte zudem signifikante Variationen in den Einschlussniveaus und unterschiedliche Spleißmuster zwischen Zelltypen, die unabhängig von ihrem Genexpressionsspiegel sind. Eine spätere Benchmarking-Studie (Probst et al., BMC Genomics, 2022) zur Volltranskript-sRNAseq zeigte, dass das Smart-seq3-Protokoll die höchste Genentdeckung pro einzelner Zelle zu einem niedrigeren Preis im Vergleich zu anderen Kits bietet.

Über MGI

MGI Tech Co., Ltd. (MGI) ist an vorderster Front globaler Innovationen tätig und leistet aktiv einen Beitrag zur Lebenswissenschaft durch intelligente Innovation. Mit Präsenz in über 100 Ländern und einer Kundenbasis von 2600+ war MGIs modernste Technologie maßgeblich an der Entwicklung von über 736 Benutzerpatenten beteiligt und erleichterte die Erstellung von über 150 Petabyte an Daten. Das umfangreiche Portfolio des Unternehmens umfasst Sequenzierungsgeräte, Automatisierungsgeräte, Reagenzien und damit verbundene Produkte, die verschiedene Bereiche wie Lebenswissenschaftsforschung, Landwirtschaft, Präzisionsmedizin und Gesundheitswesen abdecken.

MGI widmet sich der Weiterentwicklung von Lebenswissenschaftswerkzeugen für die Gesundheitsversorgung der Zukunft. Bis Dezember 2021 hat die weltweite Präsenz des Unternehmens in mehr als 100 Länder und Regionen zugenommen und bedient über 1.300 internationale Kunden. Mit einer Belegschaft von über 2.900 Fachleuten weltweit, einschließlich 5 Forschungs- und Entwicklungszentren und Produktionsstätten in Europa, engagiert sich MGI für Innovation. Etwa 35% der Mitarbeiter von MGI sind in der Forschung und Entwicklung tätig und unterstreichen den Fokus des Unternehmens auf wegweisende Fortschritte auf dem Gebiet.

Die Auswirkungen der Arbeit von MGI werden durch die Veröffentlichung von über 6.800 Artikeln in angesehenen wissenschaftlichen Zeitschriften deutlich, was den signifikanten Beitrag der Technologie von MGI für die wissenschaftliche Gemeinschaft und darüber hinaus zeigt.

Weitere Informationen über MGI und seinen Beitrag zu den Lebenswissenschaften und dem Gesundheitswesen finden Sie auf der MGI-Website oder treten Sie mit uns über Twitter, LinkedIn oder YouTube in Verbindung.

Fortschritte in der Einzelzellsequenzierung

Smart-seq3xpress

Wegweisendes Full-Length scRNAseq:

hPBMC-Studien

Präzisionsmedizin

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Urheberrecht © 2024 MGI tech GmbH, Ltd. Alle Rechte vorbehalten.

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