Smart-seq3Xpress : une méthodologie de séquençage complet de l'ARN à cellule unique, évolutive, hautement sensible et à faible coût.

5 mars 2024

Share article
Dr. Weilin Liu, scientifique principal en application sur le terrain

Dr. Weilin Liu, scientifique principal en application sur le terrain

Smart-seq3Xpress : une méthodologie de séquençage complet de l'ARN à cellule unique, évolutive, hautement sensible et à faible coût.
Smart-seq3Xpress : une méthodologie de séquençage complet de l'ARN à cellule unique, évolutive, hautement sensible et à faible coût.
Smart-seq3Xpress : une méthodologie de séquençage complet de l'ARN à cellule unique, évolutive, hautement sensible et à faible coût.

Séquençage de cellule unique, qui fournit une résolution élevée des différences cellulaires en séquençant les informations d'acides nucléiques, à savoir l'ADN et l'ARN, à partir de cellules individuelles, est devenu l'une des applications clés dans le séquençage de nouvelle génération (NGS) pour mieux comprendre l'hétérogénéité individuelle dans les processus physiologiques et les différences personnelles dans la réponse aux traitements médicaux, éclairant la découverte de nouveaux mécanismes biologiques et de thérapies personnalisées.

Actuellement, la plupart des méthodes de séquençage d'ARN de cellule unique (scRNA-seq) cartographient une courte partie des molécules d'ARN, à partir soit de l'extrémité 5' ou 3', avec un identifiant moléculaire unique (UMI)(Mereu et al., Nat. Biotechnol, 2020). Ces stratégies de décompte des extrémités d'ARN se sont révélées efficaces pour estimer l'expression génique à travers un grand nombre de cellules, tout en contrôlant les biais d'amplification PCR attribués à une faible entrée d'ARN et en compensant la capacité de séquençage, mais la couverture limitée de ces méthodes obscurcit fortement la détection des variations génétiques transcrites et de l'expression d'isoformes de transcrit causées, par exemple, par l'épissage alternatif de l'ARN, qui est un mécanisme courant du processus d'ARN et des anomalies dans un tel processus ont été associées au développement de diverses maladies, telles que les cancers et les maladies neurodégénératives (Zhang et al., Nature, 2021; Garcia-Blanco et al., Nat. Biotechnol, 2004; Mills et al., Neurobiol Aging, 2012).   De plus, bien que ces scRNA-seq de décompte des extrémités permettent une capacité de séquençage à haut débit en termes de nombre de cellules, leur sensibilité relativement faible et leur coût élevé constituent les principaux obstacles à relever. Parallèlement, les technologies de séquençage à longs lectures permettent une quantification directe de l'expression au niveau des allèles et des isoformes, cependant, leur profondeur de lecture actuelle, leur taux d'erreur biaisé et les procédures de préparation des échantillons entravent leurs applications étendues à travers les cellules, les tissus et les organismes (Byrne et al., Nat. Commum, 2017; Gupta et al., Nat. Biotechnol, 2018)

Pour surmonter ces inconvénients techniques, Hagemann-Jensen et Ziegenhain et al. au Karolinska Institute (Nat. Biotechnol, 2022; Nat. Biotechnol, 2020. https://www.nature.com/articles/s41587-022-01311-4) ont développé et optimisé davantage une méthode de séquençage basée sur des lectures courtes et sensibles, Smart-seq3xpress, pour permettre une couverture d'ARN pleine longueur et, plus important encore, offrir une résolution sans précédent des ARN individuels par rapport aux isoformes et à leur origine allélique dans les cellules uniques, avec des coûts d'exploitation réduits et une durée de préparation de la bibliothèque raccourcie à une seule journée de travail. Le protocole bien établi Smart-seq3xpress implémente UMI à l'extrémité 5' des transcrits d'ARN pleine longueur pour établir une identité unique de chaque molécule d'ARN, ainsi l'inclusion d'UMI renforce la détection des variations du nombre de copies de transcrits (CNV) et surmonte les biais causés par les processus d'amplification PCR, augmentant ainsi la sensibilité et la spécificité du séquençage. De plus, Smart-seq3xpress est une méthode basée sur des plaques, qui peut facilement être mise à l'échelle à partir de plaques de 96 à 384 puits, éventuellement facilitée par des processus d'automatisation. Plus pratiquement, le tri des cellules d'intérêt dans les plaques peut être séparé de manière spatiale et temporelle, car les plaques remplies peuvent être congelées à tout moment jusqu'à leur traitement ultérieur, ce qui constitue un avantage majeur par rapport à la méthode nécessitant une suspension cellulaire viable à être traitée immédiatement. De plus, cette étude a également consenti des efforts substantiels pour miniaturiser les facteurs clés du scRNA-seq, notamment en réduisant le volume de réaction, en diminuant l'entrée de l'ADNc, en réduisant les cycles PCR et en ajustant le rapport Tn5 et ADNc pour une tagmentation plus économique sans compromettre les performances de détection. De plus, l'ajustement des composants et de la concentration en sel nécessaires aux réactions, la mise en œuvre de nouveaux enzymes et le réglage unique d'un contrôle de dénombrement d'ARN étendu en utilisant le package R nouvellement développé UMIcountR pour améliorer encore la puissance de détection globale de Smart-seq3xpress. En outre, cette méthode fournit une solution plus respectueuse de l'environnement et économique car le matériau et les ressources sont dix fois moins importants par rapport à d'autres méthodes de séquençage d'ARN et l'utilisation du plastique est considérablement réduite par de nouveaux outils imprimés en 3D et par la distribution de réactifs sans contact ainsi que par des amorces d'index prédispersées desséchées.`

fig. 1 | Couverture évolutive complète du transcriptome par scRNA-seq avec Smart-seq3xpress. a, Schéma des réactions de synthèse d'ADN en nanolitres réalisées dans des puits de plaques de PCR à 384 puits avec 3 µl de superposition hydrophobe. b, Illustration des expériences à volume réduit avec les volumes de lyse, de RT et de PCR utilisés. c, Le nombre de gènes détectés par cellule HEK293TF à chaque volume de réaction, lors de l'échantillonnage de 100 000 lectures séquentielles (n= 100, 19, 32 et 28 cellules, respectivement). La valeur de P représente un test t bilatéral entre les conditions de 10 µl et de 1 µl. d, Influence des superpositions hydrophobes sur la synthèse d'ADN miniaturisée (volume total de 1 µl). Pour chaque composé, les boîtes représentent le nombre de gènes détectés par cellule HEK293FT (n= 17, 34, 39, 28, 25, 24, 28, 38 et 70, respectivement), sous-échantillonnées à 200 000 lectures séquentielles par cellule. e, Remplacement du nettoyage d'ADNc à base de billes par dilution dans des cellules HEK293FT uniques (n= 58 et 52, respectivement). Les boîtes montrent le nombre de gènes détectés par cellule et condition (à 100 000 lectures) avec la valeur P pour un test t bilatéral entre les conditions. f, Complexité de la Tagmentation en utilisant 0,1 µl de l'enzyme ATM Tn5 par cellule HEK293FT par rapport à l'ADNc d'entrée. Le nombre médian de gènes détectés en fonction des lectures séquentielles brutes (n= 51, 53, 54, 53, 53 et 52 cellules pour 25, 50, 75, 100, 200 et 500 pg, respectivement). g, Complexité de la Tagmentation pour des quantités variables d'ADNc d'entrée. La complexité a été résumée sous forme de paires de lectures uniques alignées et attribuées à des gènes pour 400 000 lectures brutes et cellule HEK293FT (n= 49, 51, 51, 50, 51 et 44). h, Schéma général des workflows Smart-seq3 et Smartseq3xpress. i, Le nombre de gènes détectés avec Smart-seq3xpress après des quantités variables de cycles de PCR de pré-amplification. Le nombre médian de gènes est rapporté en fonction des lectures séquentielles brutes dans les cellules HEK293FT (n= 93, 98, 108, 113, 102, 114 et 118 cellules pour 10, 12, 13, 14, 15, 16 ou 20 cycles, respectivement). j, Fraction de lectures contenant des UMI par rapport aux lectures internes pour les cellules HEK293FT préparées avec Smartseq3xpress (KAPA HiFi ; 12 cycles PCR), sur une plage variable de quantités de TDE1 Tn5 (n= 64 cellules chacune). k, Fraction de lectures contenant des UMI par rapport aux lectures internes pour les cellules HEK293FT préparées avec Smartseq3xpress (SeqAmp ; 12 cycles PCR), sur une plage variable de quantités de TDE1 Tn5 (n= 60 cellules chacune). l,m, Optimisation des conditions de RT et de PCR sur 376 conditions expérimentales sur des cellules HEK293FT. Les couleurs indiquent des conditions expérimentales particulières : Smart-seq3xpress avec Smart-seq3 TSO (violet ; n= 912), RT à 52 °C / implémentation alternée TSO (jaune ; n= 74), variante de TSO à espaceur fixe (bleu ; n= 45), variante de TSO FLASH-seq (vert ; n= 55), Smart-seq3xpress avec TSO amélioré (rose ; n= 63) et toutes les autres conditions (gris ; n= 21 707). Les graphiques en nuage indiquent le niveau de lectures TSO-UMI artificielles et les erreurs de comptage d'ARN (l) ainsi que le pourcentage de lectures mappées d'ARN ribosomal (rARN) et le nombre de gènes détectés sur 100 000 lectures après élimination des lectures d'invasion de brin (m). n, Évaluation comparative des variants Smart-seq3. Les boîtes montrent le nombre de gènes détectés par cellule HEK293FT dans les implémentations Smart-seq3 à volume complet (ref. 2), Smart-seq3 à faible volume et Smart-seq3xpress, aux profondeurs de lectures indiquées (n= 109–110, 18–27, 9–170, 20–55 et 9–63 cellules, en fonction des cellules disponibles aux profondeurs de lectures données). Les boîtes (dans c, d, e, j, k et n) montrent la médiane et les premier et troisième quartiles sous forme de boîte, et les moustaches indiquent les points de données les plus extrêmes dans 1,5 longueur de la boîte. cSt, centistoke.

Pour démontrer Smart-seq3xpress, Hagemann-Jensen et Ziegenhain et al. ont examiné 26 260 cellules mononucléées du sang périphérique humain (hPBMC) avec une profondeur moyenne de 258 000 paires de lectures par cellule. Les résultats ont fourni un profilage complet des transcrits en longueur et ont montré la reconstruction des séquences des récepteurs des lymphocytes T, identifiant plusieurs types et états de cellules, y compris des populations de lymphocytes T non conventionnels tels que MAIT et les lymphocytes T gamma-delta, avec une détection de gènes plus élevée à travers les types de cellules. Notamment, ces résultats sont obtenus en utilisant presque 10 fois moins de hPBMC par rapport à la méthode de sc-RNAseq basée sur des gouttelettes. Dans l'étude comparative suivante avec une méthode basée sur des gouttelettes, Smart-seq3xpress a donné des performances nettement supérieures sous de multiples aspects en termes de détection de polymorphismes mononucléotidiques (SNP) (9 fois plus élevée), un support de lecture supérieur sur les jonctions exon-exon/exon-intron par sa couverture en ARN en longueur et une cohérence de regroupement des lymphocytes T. L'étude des données Smart-seq3xpress hPBMC sur l'épissage alternatif a en outre révélé une variation significative des niveaux d'inclusion et des motifs d'épissage distincts entre les types de cellules, indépendants de leur niveau d'expression génique. Une étude ultérieure de référence (Probst et al., BMC Genomics, 2022) sur la scRNAseq en longueur a indiqué que le protocole Smart-seq3 présentait la détection de gènes la plus élevée par cellule unique à un prix inférieur par rapport à d'autres kits.

À propos de MGI

MGI Tech Co., Ltd. (MGI) est à l'avant-garde de l'innovation mondiale, contribuant activement aux sciences de la vie grâce à une innovation intelligente. Avec une présence dans plus de 100 pays et une clientèle de plus de 2600 personnes, la technologie de pointe de MGI a été déterminante dans le développement de plus de 736 brevets d'utilisateur, facilitant la création de plus de 150 pétaoctets de données. Le vaste portefeuille de l'entreprise comprend des instruments de séquençage, des instruments d'automatisation, des réactifs et des produits associés qui répondent à divers secteurs tels que la recherche en sciences de la vie, l'agriculture, la médecine de précision et les soins de santé.

MGI s'engage à faire progresser les outils de sciences de la vie pour les soins de santé du futur. En décembre 2021, la présence mondiale de l'entreprise s'était étendue à plus de 100 pays et régions, desservant plus de 1300 clients internationaux. Avec un effectif de plus de 2900 professionnels dans le monde entier, dont 5 centres de recherche et développement et des installations de production en Europe, MGI s'engage à favoriser l'innovation. Environ 35% des employés de MGI sont impliqués dans la R&D, soulignant la focalisation de l'entreprise sur des avancées pionnières dans le domaine.

L'impact du travail de MGI est également attesté par la publication de plus de 6 800 articles dans des revues scientifiques prestigieuses, mettant en évidence la contribution significative de la technologie de MGI à la communauté scientifique et au-delà.

Pour plus d'informations sur MGI et ses contributions aux sciences de la vie et aux soins de santé, veuillez visiter le site web de MGI ou nous contacter sur Twitter, LinkedIn, ou YouTube.

Avancées dans le séquençage de cellules uniques

Smart-seq3xpress

Pionnier Full-Length scRNAseq :

Études hPBMC

Médecine de précision

Médecine de précision

Partager cet article :

Partager

Plus de Science

La transcriptomique spatiale monocellulaire (sc-StereoSeq), ouvrant une nouvelle ère dans la biologie des plantes et des cultures.
La transcriptomique spatiale monocellulaire (sc-StereoSeq), ouvrant une nouvelle ère dans la biologie des plantes et des cultures.
La transcriptomique spatiale monocellulaire (sc-StereoSeq), ouvrant une nouvelle ère dans la biologie des plantes et des cultures.
La transcriptomique spatiale monocellulaire (sc-StereoSeq), ouvrant une nouvelle ère dans la biologie des plantes et des cultures.

10 janv. 2024

La transcriptomique spatiale monocellulaire (sc-StereoSeq), ouvrant une nouvelle ère dans la biologie des plantes et des cultures.

Découvrez comment sc-StereoSeq transforme notre compréhension de la biologie des plantes, de la production de cultures aux réponses au stress des plantes, marquant une nouvelle ère en transcriptomique spatiale.

La prochaine génération de séquençage peut-elle accélérer le développement de vaccins à ARNm ?
La prochaine génération de séquençage peut-elle accélérer le développement de vaccins à ARNm ?
La prochaine génération de séquençage peut-elle accélérer le développement de vaccins à ARNm ?
La prochaine génération de séquençage peut-elle accélérer le développement de vaccins à ARNm ?

10 oct. 2023

La prochaine génération de séquençage peut-elle accélérer le développement de vaccins à ARNm ?


Impact du séquençage nouvelle génération sur les vaccins ARNm : innovations, défis, et technologies comme VAX-seq pour la production et la qualité.

Un être humain complet Y pour poser plus de "Pourquoi" en biologie
Un être humain complet Y pour poser plus de "Pourquoi" en biologie
Un être humain complet Y pour poser plus de "Pourquoi" en biologie
Un être humain complet Y pour poser plus de "Pourquoi" en biologie

1 sept. 2023

Un être humain complet Y pour poser plus de "Pourquoi" en biologie

Déverrouillez les mystères du chromosome Y humain avec les découvertes de pointe de MGI. Découvrez comment l'étude du consortium T2T corrige les erreurs de GRCh38, révèle plus de 30 Mb de nouvelles données de séquence et fait progresser notre compréhension des structures géniques et de leurs implications dans l'Omic-verse.

Inscrivez-vous à notre newsletter pour rester informé des fonctionnalités et des sorties.

J'ai lu et compris la Politique de confidentialité de MGI et je consens à la collecte et au traitement de mes données personnelles pour le traitement, la réponse à mon contact, la réception de votre bulletin d'information ainsi que les activités de promotion et de marketing.

Droits d'auteur © 2024 MGI tech GmbH, Ltd. Tous droits réservés.

Inscrivez-vous à notre newsletter pour rester informé des fonctionnalités et des sorties.

J'ai lu et compris la Politique de confidentialité de MGI, et je consens à la collecte et au traitement de mes données personnelles pour le traitement, la réponse à mon contact, la réception de votre bulletin d'information ainsi que pour les activités de promotion et de marketing.

Droits d'auteur © 2024 MGI tech GmbH, Ltd. Tous droits réservés.

Inscrivez-vous à notre newsletter pour rester informé des fonctionnalités et des sorties.

J'ai lu et compris la Politique de confidentialité de MGI et je consens à la collecte et au traitement de mes données personnelles pour le traitement, la réponse à mon contact, la réception de votre bulletin d'information ainsi que les activités de promotion et de marketing.

Droits d'auteur © 2024 MGI tech GmbH, Ltd. Tous droits réservés.