Smart-seq3Xpress: масштабируемая, высокочувствительная и недорогая методология одиночной клеточной секвенирования полной длины РНК.

5 мар. 2024 г.

Share article
Доктор Вэйлин Лю, старший научный сотрудник по прикладным исследованиям

Доктор Вэйлин Лю, старший научный сотрудник по прикладным исследованиям

Smart-seq3Xpress: масштабируемая, высокочувствительная и недорогая методология одиночной клеточной секвенирования полной длины РНК.
Smart-seq3Xpress: масштабируемая, высокочувствительная и недорогая методология одиночной клеточной секвенирования полной длины РНК.
Smart-seq3Xpress: масштабируемая, высокочувствительная и недорогая методология одиночной клеточной секвенирования полной длины РНК.

Секвенирование одиночных клеток, которое обеспечивает высокое разрешение различий между клетками путем секвенирования информации нуклеиновых кислот, а именно ДНК и РНК отдельных клеток, стало одним из ключевых приложений в секвенировании следующего поколения (NGS) для лучшего понимания индивидуальной гетерогенности в физиологических процессах и личных различий в реакции на медицинские лечения, проливая свет на обнаружение новых биологических механизмов и персонализированные терапии.

В настоящее время большинство методов секвенирования РНК одиночных клеток (scRNA-seq) отображают короткую часть молекул РНК, либо с 5′, либо с 3′ конца, вместе с уникальным идентификатором молекулы (UMI)(Mereu et al., Nat. Biotechnol, 2020). Эти стратегии подсчета концов РНК были эффективны в оценке экспрессии генов в большом количестве клеток, контролируя при этом смещения усиления ПЦР, обусловленные низким входным количеством РНК и компенсируя емкость секвенирования, но ограниченный охват этих методов существенно затрудняет обнаружение транскрибируемых генетических вариаций и экспрессии транскриптных изоформ, вызванных, например, альтернативным сплайсингом РНК, который является общим механизмом обработки РНК, и аномалии в таком процессе показали связь с развитием различных заболеваний, таких как рак и нейродегенеративные заболевания (Zhang et al., Nature, 2021; Garcia-Blanco et al., Nat. Biotechnol, 2004; Mills et al., Neurobiol Aging, 2012).   Более того, несмотря на то, что эти методы подсчета концов scRNA-seq обеспечивают более высокую емкость секвенирования по количеству клеток, их относительно низкая чувствительность и высокая стоимость являются основными препятствиями, с которыми нужно бороться. Тем не менее, технологии секвенирования длинных чтений позволяют прямую оценку уровня экспрессии алельных и изоформных уровней, однако их текущая глубина считывания, склонность к ошибкам и процедуры подготовки образцов мешают их широкому применению в клетках, тканях и организмах (Byrne et al., Nat. Commum, 2017; Gupta et al., Nat. Biotechnol, 2018)

Чтобы преодолеть эти технические недостатки, Хагеманн-Йенсен и Зигенхаин и др. в Королинском институте (Nat. Biotechnol, 2022; Nat. Biotechnol, 2020. https://www.nature.com/articles/s41587-022-01311-4) разработали и дальше оптимизировали масштабируемый и чувствительный метод секвенирования на основе коротких чтений, Smart-seq3xpress, чтобы обеспечить полное покрытие РНК во всей длине и, что более важно, обеспечить беспрецедентное высокое разрешение индивидуальных РНК до их изоформ и аллельного происхождения в одной клетке с более низкой операционной стоимостью и сокращенной длительностью подготовки библиотеки до одного рабочего дня. Хорошо зарекомендовавший себя протокол Smart-seq3xpress реализует UMI в 5′-конце полных транскриптов РНК, чтобы установить уникальную идентичность каждой молекулы РНК, включение UMI усиливает обнаружение вариации числа копий транскрипта (CNV) и преодолевает смещения, вызванные процессами усиления ПЦР, дополнительно повышая чувствительность и специфичность секвенирования. Более того, Smart-seq3xpress – это метод, основанный на плашке, который может быть легко масштабирован от 96- до 384-луночных плашек, возможно, упрощенный автоматизацией. Более практично, сортировка клеток интереса в плашки может быть разделена пространственно и временно, так как заполненные плашки могут быть заморожены в любое время до дальнейшей обработки, что представляет собой значительное преимущество по сравнению с методом, который требует немедленной обработки подвижной клеточной суспензии. Кроме того, в этом исследовании также приложены значительные усилия по миниатюризации ключевых факторов в scRNA-seq, включая снижение объема реакции, уменьшение ввода кДНК, сокращение циклов ПЦР и настройку соотношения Tn5 и кДНК для более эффективной маркировки без ущерба для производительности обнаружения. Кроме того, настройка компонентов соли и концентрации, необходимых для реакций, внедрение новых ферментов и уникальная установка экстенсивного качественного контроля числа РНК с использованием созданного самими авторами пакета R UMIcountR, чтобы дальше улучшить общую мощность обнаружения Smart-seq3xpress. Кроме того, этот метод обеспечивает более экологически чистое и экономически целесообразное решение, потому что материалы и ресурсы в десять раз меньше по сравнению с другими методами секвенирования РНК, и использование пластиковых потребностей существенно снижается за счет новых 3D-напечатанных инструментов и бесконтактной подачи реагентов, а также предварительной маркировки высушенными индексными праймерами.

рис. 1 | Масштабируемое покрытие полным транскриптом scRNA-Seq с помощью методики Smart-seq3xpress. а, Схема реакций синтеза нанолитрового cDNA, проводимых в ячейках 384-х пучковых ПЦР-плашек с 3 мкл гидрофобного оверлея. б, Иллюстрация экспериментов с сниженным объемом с использованием лития, RT и объемов ПЦР. в, Количество обнаруженных генов на клетку HEK293TF при каждом объеме реакции при отборе 100,000 секвенированных чтений (n= 100, 19, 32 и 28 клеток, соответственно). P-значение представляет собой двусторонний t-тест между условиями 10-мкл и 1-мкл. д, Влияние гидрофобных наложений на миниатюризированный синтез cDNA (общий объем 1 мкл). Для каждого соединения коробки изображают количество обнаруженных генов на клетку HEK293FT (n= 17, 34, 39, 28, 25, 24, 28, 38 и 70, соответственно), подвыборка на 200,000 секвенированных чтений на клетку. е, Замена очистки cDNA на основе бисерной замены растворением в одной клетке HEK293FT (n= 58 и 52, соответственно) клетки. Ящики показывают количество обнаруженных генов на клетку и условие (при 100,000 чтений) с P-значением для двустороннего t-теста между условиями. ф, Сложность тагментации с использованием 0.1 мкл фермента ATM Tn5 на клетку HEK293FT относительно входного cDNA. Медиана обнаруженного количества генов в зависимости от сырых секвенированных чтений (n= 51, 53, 54, 53, 53 и 52 клетки при 25, 50, 75, 100, 200 и 500 пг, соответственно). г, Сложность тагментации для различных объемов входного cDNA. Сложность была суммирована как уникальные выровненные и геномнозначенные UMI-содержащие пары прочтений на 400,000 сырых прочтений и клетку HEK293FT (n= 49, 51, 51, 50, 51 и 44). h, Схематический контур методологий Smart-seq3 и Smartseq3xpress. я, Количество обнаруженных генов с помощью Smart-seq3xpress после переменного количества циклов предварительного усиления ПЦР. Медианное количество генов отчетливо показывается в зависимости от сырых секвенированных чтений в клетках HEK293FT (n= 93, 98, 108, 113, 102, 114 и 118 клеток для 10, 12, 13, 14, 15, 16 или 20 циклов соответственно). j, Доля UMI-содержащих прочтений внутренних чтений для клеток HEK293FT, подготовленных с помощью Smartseq3xpress (KAPA HiFi; 12 циклов ПЦР), в переменном диапазоне количества TDE1 Tn5 (n= 64 клеток каждый). k, Доля UMI-содержащих прочтений внутренних чтений для клеток HEK293FT, подготовленных с помощью Smartseq3xpress (SeqAmp; 12 циклов ПЦР), в переменном диапазоне количества TDE1 Tn5 (n= 60 клеток каждый). л,м, Оптимизация условий RT и ПЦР на 376 экспериментальных условиях на клетках HEK293FT. Цвета указывают на конкретные экспериментальные условия: Smart-seq3xpress с Smart-seq3 TSO (фиолетовый; n= 912), 52 °C RT/альтернативная реализация TSO (желтый; n= 74), фиксированный вариант промежутка TSO (синий; n= 45), вариант TSO для FLASH-seq (зеленый; n= 55), Smart-seq3xpress с улучшенным TSO (розовый; n= 63) и все остальные условия (серый; n= 21,707). Графики рассеивания обозначают уровень искусственных TSO-UMI прочтений и ошибок при подсчете РНК (л), а также процент конечных распределенных прочтений и количества обнаруженных генов в 100,000 прочтений после удаления чтений о вторжении в цепь (м). n, Бенчмаркинг вариантов Smart-seq3. Ящики показывают количество обнаруженных генов на клетку HEK293FT в полном объеме реализации Smart-seq3 (ссылка 2), реализации Smart-seq3 с низким объемом и Smart-seq3xpress для указанных глубин секвенирования (n= 109–110, 18–27, 9–170, 20–55 и 9–63 клетки, в зависимости от доступных клеток при заданных глубинах секвенирования). Ящики (в c, d, e, j, k и n) показывают медиану и первый и третий квартили в виде ящика, а усики указывают на наиболее экстремальные точки данных в пределах 1,5 длины ящика. cSt, центисток.

Для демонстрации Smart-seq3xpress Hagemann-Jensen и Ziegenhain et al. изучили 26 260 мононуклеарные клетки периферической крови человека (hPBMCs) средней глубиной 258 000 пар чтения на клетку. Результаты предоставили полный профиль транскриптов и показали реконструкцию последовательностей Т-клеточных рецепторов, выявив несколько типов и состояний клеток, включая непривычные популяции Т-клеток, такие как MAIT, и гамма-дельта Т-клетки, с более высоким обнаружением генов у различных типов клеток. Следует отметить, что эти результаты достигаются практически в 10 раз меньшим количеством hPBMCs по сравнению с методом sc-RNAseq, основанным на каплях. В последующем сравнительном исследовании с методом на основе капель Smart-seq3xpress показал более высокую производительность в нескольких аспектах, в том числе обнаружение однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) (в 9 раз выше), более высокую поддержку чтения по экзон-экзон/экзон-интронным стыкам благодаря своему покрытию всей длины РНК и согласованность кластеризации Т-клеток. Изучение данных Smart-seq3xpress hPBMC по альтернативному сплайсингу также показало значительное варьирование уровня включения и различные узоры сплайсинга среди типов клеток, не зависящие от уровня экспрессии их генов. Позднее бенчмаркинговое исследование (Probst et al., BMC Genomics, 2022) по полноразмерному scRNAseq показало, что протокол Smart-seq3 представляет самое высокое обнаружение генов на одну клетку по более низкой цене по сравнению с другими наборами.

О МГИ

Компания MGI Tech Co., Ltd. (MGI) находится на передовых позициях глобальной инновации, активно способствуя жизни через интеллектуальные инновации. С наличием в более чем 100 странах и клиентской базой из 2600+, передовая технология MGI была инструментальной в разработке 736+ пользовательских патентов, способствуя созданию более 150 петабайт данных. Обширный портфель компании включает приборы для секвенирования, приборы для автоматизации, реагенты и связанные продукты, охватывающие различные секторы, такие как исследования в области жизни, сельское хозяйство, точная медицина и здравоохранение.

MGI посвятила себя развитию инструментов для жизни будущего. К декабрю 2021 года глобальное присутствие компании расширилось до более чем 100 стран и регионов, обслуживая более чем 1300 международных клиентов. Сотрудников компании более 2900 специалистов по всему миру, включая 5 центров исследований и разработок и производственные мощности в Европе, уделяется приблизительно 35% сотрудников. Размещение более 6800 научных статей в престижных научных журналах подтверждает значительный вклад технологии MGI в научное сообщество и не только.

Для получения дополнительной информации о MGI и его вкладе в науку и здравоохранение посетите веб-сайт MGI или свяжитесь с нами в Twitter, LinkedIn или YouTube.

Продвижения в одноклеточной секвенировании

Smart-seq3xpress

Первоначальное полноразмерное scRNAseq:

Исследования hPBMC

Медицина точного прогнозирования

Медицина точного прогнозирования

Поделиться этой статьей :

Поделиться

Больше Науки

Одноклеточная пространственная транскриптомика (sc-StereoSeq) - открытие новой эры в биологии растений и сельском хозяйстве.
Одноклеточная пространственная транскриптомика (sc-StereoSeq) - открытие новой эры в биологии растений и сельском хозяйстве.
Одноклеточная пространственная транскриптомика (sc-StereoSeq) - открытие новой эры в биологии растений и сельском хозяйстве.
Одноклеточная пространственная транскриптомика (sc-StereoSeq) - открытие новой эры в биологии растений и сельском хозяйстве.

10 янв. 2024 г.

Одноклеточная пространственная транскриптомика (sc-StereoSeq) - открытие новой эры в биологии растений и сельском хозяйстве.

Изучите, как sc-StereoSeq преобразует наше понимание растительной биологии, от производства урожая до реакций растений на стресс, знаменуя новую эру в пространственной транскриптомике.

Может ли секвенирование следующего поколения ускорить разработку вакцин на основе мРНК?
Может ли секвенирование следующего поколения ускорить разработку вакцин на основе мРНК?
Может ли секвенирование следующего поколения ускорить разработку вакцин на основе мРНК?
Может ли секвенирование следующего поколения ускорить разработку вакцин на основе мРНК?

10 окт. 2023 г.

Может ли секвенирование следующего поколения ускорить разработку вакцин на основе мРНК?

Исследуйте трансформационное влияние секвенирования следующего поколения в разработке вакцин mRNA. Погрузитесь в открытия, удостоенные Нобелевской премии, вызовы и новые технологии, такие как рабочий процесс VAX-seq, улучшающие производство вакцин, безопасность и анализ качества в условиях мировых здравоохранительных кризисов.

Полноценный человек Y, чтобы задавать больше "Почему" в биологии
Полноценный человек Y, чтобы задавать больше "Почему" в биологии
Полноценный человек Y, чтобы задавать больше "Почему" в биологии
Полноценный человек Y, чтобы задавать больше "Почему" в биологии

1 сент. 2023 г.

Полноценный человек Y, чтобы задавать больше "Почему" в биологии

Раскройте тайны человеческого Y-хромосомы с помощью передовых открытий MGI. Узнайте, как исследование консорциума T2T исправляет ошибки GRCh38, раскрывает новые данные об объеме более 30 мб и продвигает наше понимание генных структур и их значение в Оми-вселенной.

Присоединяйтесь к нашему информационному бюллетеню, чтобы быть в курсе новых функций и выпусков.

Я прочитал и понял Политику конфиденциальности MGI, и даю согласие на сбор и обработку моих персональных данных для обработки, ответа на мой контакт, получения вашего информационного бюллетеня, а также на проведение промоакций и маркетинговых мероприятий.

Присоединяйтесь к нашему информационному бюллетеню, чтобы быть в курсе новых функций и выпусков.

Я прочитал и понял Политику конфиденциальности MGI, и даю согласие на сбор и обработку моих персональных данных для обработки, ответа на мой контакт, получения вашего информационного бюллетеня, а также на проведение промоакций и маркетинговых мероприятий.

Присоединяйтесь к нашему информационному бюллетеню, чтобы быть в курсе новых функций и выпусков.

Я прочитал и понял Политику конфиденциальности MGI, и даю согласие на сбор и обработку моих персональных данных для обработки, ответа на мой контакт, получения вашего информационного бюллетеня, а также на проведение промоакций и маркетинговых мероприятий.